摘要：與老齡化相關(guān)的慢性退行性疾病的整體發(fā)病率增加使得傷口治療成為極大的社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此，開發(fā)新的傷口治療方法以改善傷口愈合的需求不斷增加。再生治療的應(yīng)用因其低侵入性而變得越來越受人青睞。富含血小板血漿（PRP）因?yàn)槠浯碳ず痛龠M(jìn)傷口愈合的潛力而備受關(guān)注。PRP中的細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子在愈合過程中可發(fā)揮關(guān)鍵作用。本文將對(duì)新的傷口再生治療方法進(jìn)行綜述，尤其是關(guān)于PRP和生長(zhǎng)因子在傷口愈合過程中的作用。
1. 介紹
PRP是一種內(nèi)源性的治療手段，由于其在刺激和促進(jìn)組織愈合方面的潛力，獲得了越來越多的關(guān)注。PRP是一種直接從患者血液獲得的自體生物產(chǎn)品，全血經(jīng)過離心過程后提取出血小板濃度高于循環(huán)血液的血漿。血小板不僅具有凝血功能，而且富含細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，在組織愈合中扮演了關(guān)鍵角色。已知參與傷口愈合過程的生長(zhǎng)因子包括血小板來源生長(zhǎng)因子（PDGF）、表皮生長(zhǎng)因子（EGF）、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF）、胰島素樣生長(zhǎng)因子（IGF1, IGF2）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF-b）、角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子（KGF）（圖1）。
圖1: 參與傷口愈合過程的生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子
到目前為止，只有PDGF被美國(guó)FDA和歐洲官方批準(zhǔn)用于臨床治療。生長(zhǎng)因子是一組具有水溶性和可擴(kuò)散的多肽物質(zhì)，可調(diào)節(jié)多種細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、增殖和細(xì)胞代謝。其可促進(jìn)內(nèi)皮和表皮再生，刺激血管生成、膠原蛋白合成、軟組織愈合和止血。
使用生長(zhǎng)因子來促進(jìn)皮膚傷口愈合的歷史可以追溯到上世紀(jì)40年代，其應(yīng)用有多種方法，包括傳統(tǒng)的局部或創(chuàng)面內(nèi)應(yīng)用、或使用特殊的支架或甚至是基因治療。已有很多報(bào)道PRP成功用于治療動(dòng)物和人體的慢性皮膚潰瘍、急性皮膚傷口、燒傷和整形及美容手術(shù)。
針對(duì)皮膚傷口再生治療方法如PRP和干細(xì)胞的體內(nèi)和體外臨床和實(shí)驗(yàn)性研究取得了令人鼓舞的結(jié)果。本文將對(duì)皮膚傷口再生治療尤其是PRP進(jìn)行全面介紹。
2. 傷口愈合階段
對(duì)傷口愈合病理生理機(jī)制的深入理解顯著提高了傷口的臨床診療水平。傷口愈合是多細(xì)胞生物中最復(fù)雜的過程之一，涉及多種細(xì)胞內(nèi)和之間的眾多信號(hào)傳遞。以傷口修復(fù)為主要目標(biāo)的生物過程中有物理、化學(xué)和細(xì)胞因子的參與。
皮膚傷口的愈合機(jī)制可分為修復(fù)（Repair）或再生（Regeneration），兩種類型的愈合有著清晰和重要的區(qū)別。傷口修復(fù)中的新生組織的特征和特性遠(yuǎn)不及原本的組織，而傷口再生的目標(biāo)是用與原本組織完全一樣的組織來重建受損組織，以恢復(fù)受損組織的形態(tài)以及功能。
傷口愈合的過程通?？煞譃?/4個(gè)相互重疊的階段：止血（Haemostasis）/炎癥期（Inflammation）、細(xì)胞增殖（Proliferation）和重構(gòu)（Remodeling），受到多種細(xì)胞、細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的調(diào)控。
有多種生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、整合素、角蛋白、基質(zhì)金屬蛋白酶、趨化因子、和細(xì)胞外大分子參與和調(diào)節(jié)復(fù)雜的傷口愈合過程。下表所列為傷口愈合過程中涉及的生長(zhǎng)因子。
3. 生長(zhǎng)因子在傷口愈合過程中的作用
生長(zhǎng)因子在傷口愈合和組織再生中發(fā)揮了不可或缺的作用。信號(hào)傳導(dǎo)蛋白影響著其他細(xì)胞的代謝。每種生長(zhǎng)因子對(duì)于傷口愈合過程有超過一種效應(yīng)，其通過與靶細(xì)胞膜表面特定受體結(jié)合而發(fā)揮作用。這些作用包括促進(jìn)趨化性（吸引細(xì)胞至傷口部位）、刺激細(xì)胞遷移和增值、刺激細(xì)胞上調(diào)蛋白質(zhì)生產(chǎn)。這些生長(zhǎng)因子不僅調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移和增值，而且能重構(gòu)細(xì)胞外基質(zhì)和促進(jìn)血管生成，為皮膚傷口愈合創(chuàng)造理想的環(huán)境。
通過血小板α顆粒的脫顆粒，PRP能分泌多種不同的生長(zhǎng)因子，包括PDGF、VEGF、FGF、HGF和TGFβ（表2）。
表2: 傷口愈合過程中涉及的生長(zhǎng)因子及其來源
PDGF: 血小板來源生長(zhǎng)因子; VEGF: 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子; FGF: 成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子; HGF: 肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子; TGF: 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子
血小板所含的主要生長(zhǎng)因子
目前已知參與傷口愈合過程的主要生長(zhǎng)因子是PDGF、EGF、FGF、IGF、VEGF、TGFβ、HGF、KGF。接下來我們將描述不同生長(zhǎng)因子在傷口愈合過程中的作用。
4. 富含血小板血漿（PRP）：制備方法和治療配方
PRP可以被定義為是從全血中所提取的含有高濃度血小板的部分血漿，因而其所含生長(zhǎng)因子濃度亦很高。當(dāng)前，PRP被廣泛用于不同的臨床應(yīng)用，包括骨科愈合、軟組織愈合、神經(jīng)組織、慢性皮膚潰瘍、眼科、和牙科。PRP被美國(guó)FDA界定為是人為干預(yù)極少的組織，屬于自體血液制品。其優(yōu)勢(shì)之一是易于從患者自身血液獲取，因而安全、簡(jiǎn)便和性價(jià)比高。通過控制離心參數(shù)和激活方式，可以控制激活后釋放的生長(zhǎng)因子和蛋白質(zhì)的劑量。
目前還沒有PRP制備的金標(biāo)準(zhǔn)，也缺乏法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)。為了描述在組織再生中發(fā)揮關(guān)鍵作用的主要成分的特征和為特定的病理生理情況準(zhǔn)備足夠的制劑，良好設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)單流程是必需的，其中離心條件對(duì)于獲得高質(zhì)量的PRP是基礎(chǔ)。
近年來對(duì)于PRP的命名和定義有很大的爭(zhēng)議。有人認(rèn)為術(shù)語“富含血小板血漿（PRP）”較為模糊和不準(zhǔn)確。臨床所用的大量的自體血液制品在制備方法上有所差別，因而其定量和定性特征亦不同。因此，一份詳細(xì)的、準(zhǔn)確的和分布描述的PRP制備方案（離心條件、血小板濃度、抗凝劑類型、血小板激活劑和是否包含白細(xì)胞）對(duì)于不同研究間的比較是必要的。此外，保護(hù)血小板的完整性和質(zhì)量、防止血小板損傷或溶解以使其能完全釋放生長(zhǎng)因子是很重要的。
基于上述原因，生物技術(shù)學(xué)院（BTI）開發(fā)了一種先進(jìn)的自體PRP系統(tǒng)，制備富含生長(zhǎng)因子血漿（Plasma Rich in Growth Factors, PRGF），被稱為PRGF-Endoret。PRGF是一種自體血液產(chǎn)品，含有中等濃度的血小板，無白細(xì)胞，可提供由纖維蛋白形成的支架供細(xì)胞粘附，從而幫助傷口愈合。接下來我們將介紹幾種不同的PRP制備方法。
4.1. 制備方法
當(dāng)前PRP制備方法的技術(shù)細(xì)節(jié)上有所差別，例如是否包含白細(xì)胞或紅細(xì)胞、離心的速度和時(shí)間。盡管結(jié)果似乎是類似的。
Anitua（2004）認(rèn)為不應(yīng)該包含白細(xì)胞，因?yàn)樗麄儠?huì)改變某些GFs的功能和干擾抗炎作用。其他，如Harvest技術(shù)公司聲稱這些細(xì)節(jié)不重要，其PRP產(chǎn)品含有一些紅細(xì)胞。此外，有研究人員在治療潰瘍或其他手術(shù)時(shí)偏愛將白細(xì)胞納入，認(rèn)為其有抗菌作用。
4.1.1. PRGF系統(tǒng)（BTI Biotechnology Institute, Vitoria, Spain）
有臨床價(jià)值的PRP所含血小板濃度至少為1百萬/微升。Anitua認(rèn)為PRGF是對(duì)這種再生治療的更準(zhǔn)確的術(shù)語，必須含有相較于全血中1.5倍的血小板濃度。PRGF的主要優(yōu)勢(shì)包括：生物相容性、多用途和安全；不存在白細(xì)胞阻礙促炎效應(yīng)；標(biāo)準(zhǔn)化的血小板激活方法（使用氯化鈣）來釋放生長(zhǎng)因子；制備方法簡(jiǎn)單快速，只需一次離心（460g，8分鐘）；有抑菌特性和強(qiáng)大的治療潛力，無副作用【99】。單次離心后，紅細(xì)胞沉淀于管底，其上層為白細(xì)胞，再上層為血漿，可分為上部60%（生長(zhǎng)因子濃度低）和下層40%（PRGF）（圖2）。
圖2: PRGF制備。A：無菌條件下收集血液于含有枸櫞酸鈉的離心管中，460g離心8分鐘；B：血液被分離為3部分：主要含有血小板的血漿（最上層）、白細(xì)胞層即棕黃層（中間層）、紅細(xì)胞層（下層）；C：層流凈化罩中進(jìn)行移液；D/E：將血漿層上部（GFs含量低）和下部（GFs含量高）移至單獨(dú)的分餾管中，無添加劑；F：加入PRGF激活物（氯化鈣，50μL/ml制備液）以實(shí)現(xiàn)血小板脫粒和釋放生長(zhǎng)因子。
4.1.2. 血小板濃縮采集系統(tǒng)（PCCS Kit）（3i-Implant Innovations，Palm Beach Gardens，F(xiàn)L，USA）
該技術(shù)獲得的血小板濃度為110至220萬/μL，并且包含白細(xì)胞（5500-14800/ μL）?？鼓齽┦褂肁CD-A9，經(jīng)過2次離心：首次3分鐘45秒，3000rppm；第二次3000rpm，13分鐘。
4.1.3. 重力血小板分離（GPS System）（Biomet Merck Biomaterials，Darmstadt，Germany）
使用該方法，獲得的血小板濃度可達(dá)160萬/μL，所含白細(xì)胞濃度為31100/μL。使用60mL注射器，含有6mL抗凝劑（ACD-A）和54mL患者血液。血液在GPS管內(nèi)離心12分鐘，3200rpm。
4.1.4. 智能PReP系統(tǒng)（Harvest Technologies Corpopration，Munich，Germany）
該方法所需血液量為：女性52mL，男性48mL。采用兩次離心，獲得PRP血小板濃度約125萬/μL，白細(xì)胞濃度19261/μL。
血液分離的方法有很多，其目的均為獲得富含GFs的血漿（表3）。然而，成功需要克服多個(gè)挑戰(zhàn)，例如完整描述血小板釋放的生長(zhǎng)因子和蛋白質(zhì)、評(píng)估造成某些產(chǎn)品效果優(yōu)于其他產(chǎn)品的個(gè)別原因。
表3: PRP制備方法和主要特征
4.2. 治療配方
一個(gè)使得PRGF技術(shù)區(qū)別于其他PRP產(chǎn)品的重要特征是其多功能性。從患者血液可以獲得四種不同配方的PRGF，擁有很強(qiáng)的治療效果，賴于樣本抗凝和激活程度的不同，配合滿足不同臨床需求。該治療配方涉及：PRGF上清，用于傳統(tǒng)的滴眼液和細(xì)胞培養(yǎng)基；液體PRGF，一般用于手術(shù)和牙科植入物表面；支架樣PRGF（凝塊），由纖維和細(xì)胞組分構(gòu)成，常用于皮膚潰瘍；彈性和致密纖維膜，對(duì)于軟組織損傷和封閉手術(shù)傷口是極佳選擇（圖3）
圖3: PRGF治療配方。A：液體PRGF治療犬皮膚潰瘍；B：支架樣PRGF與松質(zhì)骨的混合物；C：PRGF纖維膜治療創(chuàng)傷性傷口。
5. 使用PRP治療皮膚傷口
過去數(shù)十年中，新的細(xì)胞療法如PRP在各種不同疾病的應(yīng)用得到了越來越多的關(guān)注。醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展趨勢(shì)是開發(fā)微創(chuàng)和性價(jià)比高的治療方法來促進(jìn)功能恢復(fù)。PRP的使用對(duì)于減少標(biāo)準(zhǔn)醫(yī)療的經(jīng)濟(jì)成本有潛在影響，盡管不應(yīng)考慮將其作為某些必要傳統(tǒng)治療（如壞死組織清創(chuàng)）的替代方法，而應(yīng)作為補(bǔ)充治療。PRP治療能為受傷區(qū)域提供某些信號(hào)傳導(dǎo)細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，這些因子通過調(diào)節(jié)炎癥、刺激血管生成和新生組織的形成和重構(gòu)，在組織修復(fù)過程中扮演關(guān)鍵作用。PRP用于皮膚傷口愈合的其他優(yōu)勢(shì)包括：方法簡(jiǎn)單、性價(jià)比高、與傳統(tǒng)治療相比效果更持久、作為自體產(chǎn)品而具有安全性。
PRP治療過程
PRP在人體和動(dòng)物的應(yīng)用穩(wěn)步增加，其促愈特性在很多臨床和實(shí)驗(yàn)室研究中有所報(bào)道。血小板因其止血功能和含有高濃度的生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子而在傷口愈合過程中發(fā)揮重要作用。高濃度的生長(zhǎng)因子能促進(jìn)表皮和內(nèi)皮細(xì)胞再生、刺激血管生成和膠原蛋白沉積、和加速愈合過程。PRP首次臨床應(yīng)用是用于慢性下肢潰瘍治療，研究中觀察到PRP刺激血管化的結(jié)締組織形成【122】。
人體臨床試驗(yàn)中PRP的主要應(yīng)用與慢性疾病相關(guān)，例如糖尿病潰瘍，該病中傷口愈合受損，由于促炎和抗炎細(xì)胞因子的失衡、低生長(zhǎng)因子濃度或過多的活性氧而表現(xiàn)為持續(xù)的炎癥狀態(tài)。在此意義上來說，生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子在控制氧化損傷方面發(fā)揮了關(guān)鍵作用。PRP中生長(zhǎng)因子的再生能力幫助縮短傷口和各種組織損傷的恢復(fù)時(shí)間。與上述結(jié)論一致，Babaei等對(duì)150例塘組潰瘍局部使用PRP后觀察到健康肉芽組織形成和傷口閉合時(shí)間的縮短【124】。使用皮下自體PRP注射加局部PRP凝膠治療不同病因的難愈潰瘍，證實(shí)自體PRP治療難愈潰瘍方面的安全性和有效性，不僅傷口尺寸顯著減小、無副作用、且損傷部位疼痛和炎癥減少【114】。在壞死性軟組織感染繼發(fā)傷口局部使用自體PRP亦取得類似積極結(jié)果【125】。此外，Man等研究顯示局部應(yīng)用自體PRP治療皮瓣后獲得皮膚傷口愈合的定量改善【127】。如前所示，幾項(xiàng)針對(duì)人體慢性傷口治療的研究顯示傷口愈合的改善，表現(xiàn)為傷口面積和體積的減小、以及傷口閉合改善。體外試驗(yàn)中，Roubelakis等【53】研究了PRP對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）和皮膚成纖維細(xì)胞的增殖和遷移特性的作用，證實(shí)其對(duì)MSC和成纖維細(xì)胞的遷移能力和增殖率有顯著誘導(dǎo)作用。此外，在真實(shí)臨床患者中，PRP敷料治療后顯示潰瘍愈合加速和受損區(qū)域血管新生速度加快。其他研究者在隨機(jī)、前瞻和回顧研究中亦獲得類似結(jié)果。因此，與傳統(tǒng)方法相比，血小板的應(yīng)用似乎獲得更快的愈合【27,131,132】。對(duì)PRP在皮膚傷口中應(yīng)用的薈萃分析，與對(duì)照傷口治療相比，PRP增強(qiáng)了傷口愈合過程，難愈急慢性傷口顯著改善，此外，PRP顯示出對(duì)金葡菌和大腸桿菌的抗菌活性【99,133】。
PRP在傷口愈合中的應(yīng)用
PRP的治愈能力依賴于血小板在生理狀態(tài)下含有多種生長(zhǎng)因子，具有很強(qiáng)的愈合功能，在組織再生中發(fā)揮重要作用。在動(dòng)物模型中使用PRP依然是檢測(cè)新型再生治療的金標(biāo)準(zhǔn)，亦有助于后續(xù)在動(dòng)物和人體的臨床應(yīng)用。有很多在狗和馬的皮膚傷口治療中使用PRP的體內(nèi)研究。Farghali等檢測(cè)了狗全層皮膚傷口周圍皮下自體PRP浸潤(rùn)注射的效果【45】。結(jié)果顯示有顯著的傷口收縮和再上皮化率。此外，與對(duì)照傷口相比，PRP治療傷口顯示出更高的膠原蛋白沉積、更快的肉芽組織形成和疤痕形成減少（膠原蛋白纖維排列更有序）。PRP刺激I型膠原蛋白和基質(zhì)金屬蛋白酶I，增加細(xì)胞周期進(jìn)展調(diào)控因子，以加速傷口愈合。PRP治療傷口中真皮膠原蛋白有序性的增強(qiáng)可能是因?yàn)槊髂z酶B（MMP-9）的增加，因其似乎對(duì)膠原蛋白纖維的裝配很重要。與上述研究一致，其他兩項(xiàng)在馬的傷口完成的臨床研究顯示出更快的表皮分化和真皮膠原蛋白有序性的增強(qiáng)【【118,139】。近期對(duì)于創(chuàng)面內(nèi)注射PRP治療狗急性皮膚傷口的研究顯示PRP治療傷口與對(duì)照組相比，宏觀和微觀均表現(xiàn)出更快的愈合，血管生成和肉芽組織形成加強(qiáng)、膠原蛋白沉積增加、再上皮化和表皮分化加速【36】。
研究顯示PRP在組織擴(kuò)增和皮膚增殖中發(fā)揮重要作用，因其可以增強(qiáng)細(xì)胞增殖、膠原蛋白合成和新生血管形成。有報(bào)道PRP與其他治療聯(lián)合使用獲得更好的結(jié)果。Lian等研究顯示PRP與骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）有協(xié)同效應(yīng)【151】。同樣，Park等研究顯示PRP+水凝膠治療小鼠傷口改善了傷口愈合，顯著縮短了愈合期和增強(qiáng)血管生成。Manuka蜂蜜（MH）因其內(nèi)在促愈能力而為人所知，在一項(xiàng)決定成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞對(duì)于添加了MH、PRGF或二者時(shí)的培養(yǎng)基的反應(yīng)，結(jié)果顯示PRGF+MH的存在增加了細(xì)胞活性，成纖維細(xì)胞的反應(yīng)最為積極【153】。
表4: 應(yīng)用PRP治療皮膚傷口的一些研究
6. 結(jié)論
由于人們對(duì)低或無創(chuàng)治療的青睞，再生治療已經(jīng)逐漸成為促進(jìn)傷口愈合的金標(biāo)準(zhǔn)。作者觀點(diǎn)認(rèn)為PRP可以作為傷口愈合的安全和高性價(jià)比治療方法，借以縮短恢復(fù)期，進(jìn)而改善患者生活質(zhì)量。
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